Apport des Nanoparticules d'alginate à la multifonction des peptides antimicrobiens, exemple de la bactériocine de classe IIb Entérocine DD14

Abstract

Dans ce projet de thèse, nous avons évalué l’apport des nanoparticules d’alginate sur la multifonction des bactériocines, en particulier l’entérocine DD14 (EntDD14). Cette bactériocine à deux peptides sans séquence leader, appartenant donc à la calsse IIb, a été caractérisée pour son activité antibactérienne contre des germes pathogènes comme Clostridium perfringens. Les nanoparticules d’alginate (AlgNPs) que nous avons utilisé ont été produites par un broyage physique, en utilisant un broyeur à billes (Retsch PM100), sans traitement chimique. Une fois les AlgNPs préparées, la bactériocine (EntDD14) est incorporée par adsorption physique à leur surface. Des analyses permettant d’établir l’activité antibactérienne contre des souches pathogènes de C. perfringens, isolées de poulets atteints d’entérite nécrotique, ont ensuite été effectuées. Ainsi, la concentration inhibitrice minimale (CMI) de la formulation, résultant de l’adsorption de l’EntDD14 sur les AlgNPs, a été diminuée d’un facteur de 4, par rapport à celle obtenue avec EntDD14 seule. Il convient de noter que la formulation mise au point dans le cadre de cette thèse reste active dans les conditions physiologiques du tractus gastrique de l'homme et du poulet reconstituées in vitro. Par ailleurs, nous avons également montré que l’EntDD14 seule, ou fixée sur les AlgNPs, ne présente aucune cytotoxicité cellulaire sur les modèles de cellulles humaines apprtenant aux lignées Caco-2 et HT-29 après 24 heures de contact. Par la suite l’impact de l’EntDD14 seule et/ou adsorbée sur des AlgNPs, à des concentrations sub-inhibitrices, sur le niveau d'expression des gènes codant pour la synthèse des toxines (toxine α, -Like toxine, la protéine d'adhésion du collagène et la cytolysine activée par le thiol) ont été déterminées. Ainsi, les niveaux d’expression de ces gènes ont été considérablement dminués après traitement de la culture avec les formulations EntDD14/AlgNPs mais pas l’adjonction de la bactériocine seule. L’augmentation de l’activité de la bactériocine par les nanoparticules, la réduction de l’expression des gènes codant les toxines impliquées dans la NE et l’absence de cytotoxité cellulaire montrent ainsi la viabilité de ce type de formulation comme alternative thérapeutique dans le traitement de cette pathologie. Afin d’évaluer l’apport des nanoparticules d’alginate sur les capacités multifonctionnelles de l’EntDD14 nous avons étudié l’impact de cette molécule, seule ou adsorbée sur les AlgNPs (à 1xCMI et 4xCMI), sur la réponse inflammatoire des cellules Caco2. Nous avons ciblé particulièrement les interleukines IL-6 et IL-8, après induction de l’inflammation avec du lipopolysacharide (LPS) (50 µg / ml) provenant d’Escherichia coli. Ainsi nous avons pu observer une réduction drastique du niveau de sécrétion de l’IL-6, passant de 2,5 pg/ml à moins de 0,5 pg/ml. Concernant l'IL-8, l'effet des différents traitements est également clairement établi, avec une diminution du niveau de sécrétion de cette interleukine d'au moins deux à trois fois en comparaison avec le contrôle inflammé mais non traité. Nous avons également étudié l'activité antivirale de la bactériocine EntDD14 libre et fixée sur les AlgNPs. Nous avons évalué cette activité contre le virus de l’herpès (HSV-1), en utilisant comme modèle des cellules Vero, provenant de reins de singe vert d’Afrique, infectées à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,07. Celles-ci ont été incubées ensuite en présence de différentes concentrations d'EntDD14 (7,5 à 150 µg/ml) et après 24 h d'incubation, une baisse significative du titre viral a été observée pour les concentrations les plus élevées (>30 µg/ml). Ainsi ces travaux ont permis de mettre en évidence la multifonctionnalité de l’entérocine DD14 ainsi que sa pertinence comme alternative ou complément aux traitements antibiotiques en association avec les nanoparticules dans le contexte de l’entérite nécrotique.