Nouveaux outils de mesure de la dynamique moléculaire appliqués à l'étude des facteurs de transcription

Abstract

Tout organisme biologique est un système complexe qui répond aux contraintes d’un programme lié à sa perpétuation et à son environnement. La régulation de la transcription est un des mécanismes fondamentaux d’adaptation du vivant. La dynamique des protéines responsables de ce mécanisme est un élément clef. Dans cette thèse, je me suis focalisée sur le complexe P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor) qui joue un rôle essentiel dans la levée de pause transcriptionnelle.En microscopie, différentes méthodes sont utilisées pour mesurer la dynamique moléculaire intra-cellulaire. Nous proposons de combiner deux d'entre elles afin de tirer avantage de leur complémentarité : la FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) et le SPT (Single Particle Tracking). Cette thèse est organisée en deux parties. D’une part j’ai utilisé ces techniques indépendamment pour analyser la dynamique de P-TEFb et de l’ARN polymérase II (Pol II). D’autre part, j’ai développé un nouvel instrument de microscopie combinant les approches SPT et FCS. Après mise au point méthodologique, j’ai étudié la dynamique de RPB1 et de CT1, et montré l’existence de deux sous-populations majoritaires diffusant avec des propriétés différentes.L’utilisation d’un mutant et d’inhibiteurs nous a permis d’analyser les mécanismes sous-jacents et de proposer un modèle de formation de clusters de P-TEFb associés à la levée de pause. Ces expériences suggèrent également que la molécule BRD4 contribue à la sous-diffusion de P-TEFb indépendamment de Pol II.Afin de poursuivre ce travail en combinant SPT et FCS sur le même échantillon, nous avons aussi développé un module de microscopie (StellarScan) intégrant plusieurs modalités de microscopie : CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) notamment pour le FCS, illuminations plein champ et TIRFM/HiLo (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy / Highly inclined and Laminated optical sheet), ainsi que la possibilité de travailler en mode feuille de lumière (Light Sheet Fluorescence Microscopy/SPIM) pour les mesures de SPT.